فصلنامه تخصصی دانش آزمایشگاهی ایران سال چهارم شماره 3 پاییز 1395 شماره پیاپی 15 کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی: روشی کارآمد برای جداسازی نویسندگان مریم یوسفی 1 و 4 * فاطمه دیرکوند 3 و 4 مقدم 2 و 4 محمود نادری مقاالت * m.yousefi@avicenna.ac.ir چکیده کروماتوگرافی مایع آبدوستی یکی از روشهای کارآمد برای جداسازی ترکیبات قطبی کوچک روی فاز ساکن قطبی است. هدف این مقاله مرور انواع فازهای ساکن به کار رفته در جداسازی و کاربرد آنها در جداسازی ترکیبات قطبی در مخلوطهایی با ترکیبات پیچیده است. ویژگیهای فاز ساکن آبدوست )از آنجا که عواملی به جز عامل آبدوستی میتوانند دخالت داشته باشند( روی انتخاب ترکیب فاز متحرک قدرت یونی آن یا میزان ph بافر اثر گذاشته و در مواردی آن را محدود میکند. گسترش دانش عملکرد بازداری ترکیبات در کروماتوگرافی مایع آبدوستی امکان افزایش گستره کاربردهای کروماتوگرافی مایع را فراهم میآورد. واژههای کلیدی کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی فاز ساکن فاز متحرک سازوکار جداسازی. 7 مقدمه توضیح نظری بازداری آنالیت در کروماتوگرافی مایع با کارایی باال 5 موضوع مقاالت علمی بسیاری بوده است. سازوکار جداسازی را براساس برهمکنشهای ویژه و غیرویژه به چندین دسته میتوان تقسیمبندی نمود: توزیعی جذب سطحی تبادل یونی و اندازه طردی. دو روش کلی کروماتوگرافی فاز نرمال و کروماتوگرافی فاز معکوس را برای جداسازی میتوان به کار گرفت. در کروماتوگرافی مایع فاز نرمال فاز ساکن قطبیتر از فاز متحرک است و میزان بازداری با کاهش قطبیت فاز متحرک افزایش مییابد. وضعیتی کامال متضاد در کروماتوگرافی فاز معکوس دیده میشود. کروماتوگرافی فاز نرمال بهطور گستردهای برای جداسازی طیف وسیعی از ترکیبات از غیرقطبی تا بسیار قطبی کاربرد دارد اگر چه در گذشته کروماتوگرافی فاز معکوس بسیار متداول بود اما امروزه کروماتوگرافی فاز نرمال دستخوش تغییرات بسیاری گردیده است. کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی 6 مانند كروماتوگرافي مایع فاز نرمال 7 یک روش جداسازی برای ترکیبات
سال چهارم شماره 3 پاییز 1395 شماره پیاپی 15 دانش آزمایشگاهی ایران فصلنامه تخصصی 8 مقاالت قطبی است با این تفاوت که جداسازی در روش کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی پیچیدهتر است. این روش برای نخستین بار توسط آلپرت در سال 1990 معرفی شد ]1[ و تعداد مقاالت منتشر شده تا سال 2003 رشد قابل مالحظهای داشت. کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی مزایای بیشتری نسبت به کروماتوگرافی مایع فاز نرمال و فاز معکوس دارد. بهعنوان مثال این روش برای ترکیبات موجود در مخلوطهای پیچیده که در کروماتوگرافی فاز معکوس در معرض شسته شدن هستند مناسب است. نمونههای قطبی همیشه برهمکنش خوبی در فاز متحرک آبی در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی دارند در حالی که این ترکیبات با مشکل حاللیت ضعیف در کروماتوگرافی فاز نرمال روبرو هستند. در اين روش به استفاده از محلولهای گران قیمت تبادل یونی نیاز نیست و میتوان آن را به راحتی با طیفسنج جرمی به روش یونیزاسیون الکترواسپری همراه کرد. در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی در مقایسه با کروماتوگرافی فاز معکوس شویش با حالل آلی با قطبیت کم آغاز شده و به روش گرادیانی شویش آنالیت با افزایش محتوای قطبیت حالل ادامه مییابد ]2[. این روش از کروماتوگرافی در واقع بهمنظور جداسازی نمونههای قطبی و یونی استفاده میشود که از این جهت مشابه کروماتوگرافی یونی است. فاز ساکن ستون در این روش از کروماتوگرافی مانند کروماتوگرافی نرمال است و همچنین فاز متحرک به کار برده شده در این روش مانند فاز متحرک استفاده شده درکروماتوگرافی فاز معکوس است. شکل )1( نمایشی از تلفیق این سه روش را به خوبی نشان میدهد. شکل 1: نموداری از تلفیق روشهای مختلف در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی ]3[ HILIC مزایای ویژهای بر کروماتوگرافی فاز نرمال و معکوس متداول دارد. برای نمونه این روش برای آنالیز ترکیبات در سیستمهای پیچیده که در کروماتوگرافی فاز معکوس جداسازی نمیشوند کارامد است. نمونههای قطبی حاللیت خوبی در حاللهای آبی دستگاه HILIC دارندکه در این حالت بر حاللیت پایین آنها در حاللهای فاز نرمال غلبه میشود. در دستگاه HILIC به واکنشگرهای زوج یون گران قیمت نیازی نیست و میتوان سیستم را با دستگاه طیفسنج جرمی به ویژه در روش یونیزاسیون الکترواسپری هم جفت نمود. برخالف کروماتوگرافی فاز معکوس شستشوی گرادیانی با حالل آلی با قطبیت کم شروع میشود و سپس آنالیتهای قطبی با افزایش میزان آب از ستون خارج میشوند ]4[. یک فاز متحرک مطلوب درصد باالیی از حالل آلی دارد تا حساسیت باالتری فراهم کند و همچنین بازداری مناسبی برای ترکیبات یونی قطبی فراهم آورد. امروزه HILIC به یک روش جداسازی مناسب برای ترکیبات غیرباردار به شدت هیدروفیل و ترکیبات آمفی فیلیک که در فاز معکوس بسیار قطبیتر از آن هستند که بازداری شوند و بار کافی هم ندارند که در کروماتوگرافی تبادل یونی به روش موثری بازداری شوند تبدیل شدهاست. HILIC مشکالتی که پیشتر در زمینه جداسازی اسیدهای آلی کوچک داروهای بازی و بسیاری دیگر از ترکیبات خنثی یا باردار وجود داشته است را حل کرده است. این روش برای آنالیز کربوهیدراتها پپتیدها و ترکیبات دارویی تاکنون استفاده شدهاست.
فصلنامه تخصصی دانش آزمایشگاهی ایران سال چهارم شماره 3 پاییز 1395 شماره پیاپی 15 9 مقاالت فازهای ساکن در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی از هر سطح قطبی میتوان برای جداسازی با روش کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی استفاده کرد. فاز ساکن معمول در این روش سیلیکا یا سیلیکای بدون پوشش است که با گروههای عاملی قطبی اصالح شدهاست. اولین نسل از این حالت جداسازی توسط لیندن و همکاران ]5[ آغاز شد که جداسازی کربوهیدراتها روی فاز ساکن آمینو - سیلیکا با مخلوطی از استونیتریل و آب با نسبتهای حجمی 75 به 25 بود. نسل بعدی از جداسازی با استفاده از فاز ساکن با پایه دی ال و آمید سیلیکا بود. ستونهای با پایه دی ال - سیلیکا در جداسازی پروتئینها استفاده شدهاند ] 6 و 7 [. پس از آن سیلیکای متخلخل با قطر ذرات 2 میکرون وارد بازار شد ولی همچنان سیلیکای بدون پوشش با 35 درصد کاربرد باالترین مورد مصرف را داشته است. در شکل )2( انواع فازهای ساکن براساس درصد کاربرد نشان داده شدهاست. جدول 1: فازهای ساکن در جداسازی به روش HILIC ماده پر کننده سیلیکای مشتقسازی نشده که دارای گروههای عاملی مانند سیلوکسان و سیالنول است به همراه )و یا بدون( مقادیر اندک فلزات فاز ساکن دی الی فاز ساکن سیانو فاز ساکن آمینو آلکیل آمید فاز ساکن آمید ساختار فاز ساکن فاز مخلوط شکل 2: انواع فازهای ساکن براساس درصد کاربرد ]8[. ساختارهای پلیمری مشتقات پلی )سوکسین ایمید( در طی پانزده سال گذشته نسل دوم و سوم فاز ساکن به بازار راه پیدا کردهاند که بیشتر این فازهای ساکن فازهای جامد با برهمکنشهای چندگانه و پیچیده هستند. تنوع فازهای ساکن در HILIC بسیار بیشتر از سیستمهای فاز معکوس است. فازهای ساکن به کار گرفته شده در HILIC را میتوان به فازهای ساکن قطبی و یونی تقسیمبندی نمود. جدول )1( ساختارهای متفاوت فاز ساکن را که در این روش کروماتوگرافی استفاده میشوند نشان میدهد. با این که تعداد و تنوع فازهای ساکن زیاد است اما هنوز فاز ساکنی مانند C18 درHILIC وجود ندارد که به اندازه آن پرکاربرد باشد. فازهای دی الی آمینو آمید و سایر فازها با اصالح شیمیایی سطح سیلیکا ژل مشابه آن چه در فاز معکوس برای C18 انجام میشود تهیه میشوند. پلی اتیلن گالیکول/سیلیکا بتا - سیکلودکسترین ساکارید )مالتوز( دی پپتید زوج یون سولفو بتایین
مقاالت 10 فازهای متحرک در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی فاز متحرک معمولی در این روش حاللهای آلی قطبی امتزاجپذیر مانند استونیتریل و آب است ]1[. با این حال حاللهای غیرپروتون دهنده 8 مانند تتراهیدروفوران و دیاکسان که قابلیت اختالط با آب را دارند نیز میتوانند مورد استفاده قرار گیرند. الکلها نیز بهعنوان فاز متحرک به کار گرفته میشوند اگر چه برای رسیدن به همان درجه بازداری نسبت به مخلوط حالل غیرپروتون دهنده و آب درصد باالتری از الکل باید استفاده شود. توانایی نسبی حاللها در شویش بهصورت خالصه در لیست زیر نشان داده شدهاست: آب< متانول~ دیمتیل فرمامید > دیاکسان< اتانول< استونیتریل< پروپانول ~ ایزوپروپانول< استون جداسازی در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی در 10 دو حالت ایزوکراتیک 9 با درصد باالیی از حالل آلی و یا گرادیان انجام میشود که در حالت گرادیان با شویش با درصد باالیی از یک حالل آلی آغاز شده و به تدریج درصد حالل آلی کاهش و به درصد حالل آبی افزوده میشود. در پایان شویش نیز درصد باالیی از حالل آبی وارد دستگاه میشود ]1[. چنین تصور میشود که در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی فاز متحرک روی سطح فاز ساکن قطبی یک الیه غنی از آب در برابر یک فاز متحرک با درصد آب کم تشکیل میشود. این حالت منجر به ایجاد یک سیستم استخراج مایع/مایع میشود و در نتیجه جداسازی با توزیع نمونه بین دو فاز متحرک مایع و فاز ساکن مایع شده انجام میشود ]9[. افزودنیهای فاز متحرک افزودنیهای یونی مانند آمونیوم استات و آمونیوم فرمات بهطور معمول برای کنترل ph و قدرت یونی فاز متحرک استفاده میشوند. در HILIC این افزودنیها در قطبیت آنالیت سهیم شده و منجر به تغییر در بازداری آنالیت میشوند. برای آنالیتهای قابل یونیزه شدن مانند آنتی بیوتیکهای آمینوگلیکوزیدی ph را باید بهگونهای تنظیم نمود که اطمینان حاصل شود تنها یک فرم یونی از آن وجود دارد. هیچ بافری برای جداسازی آنالیتهای قطبی خنثی مانند کربوهیدراتها الزم نیست. استفاده از سایر نمکها )مانند سدیم پرکلرات - 300 100 میلیموالر( را میتوان برای افزایش قطبیت فاز متحرک استفاده نمود ]10[. سازوکار کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی سازوکار کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی میتواند مانند روش کروماتوگرافی فاز معکوس شرح داده شود با این تفاوت که فاز ساکن قطبی است. در این روش فاز متحرک با درصد باالیی از حالل آلی )معموال بیشتر از 60 درصد استونیتریل( به همراه درصد سال چهارم شماره 3 پاییز 1395 شماره پیاپی 15 دانش آزمایشگاهی ایران فصلنامه تخصصی کمی از حالل آبی )بافر یا دیگر حاللهای قطبی( است. از مهمترین عوامل دخیل در این نوع کروماتوگرافی میتوان به برهمکنشهای الکترواستاتیک ضعیف و پروتون دهندگی بین نمونههای قطبی خنثی و فاز متحرک شدیدا آلی اشاره نمود )شکل )3((. بنابراین اصل اساسی جداسازی در کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی بر میزان قطبیت نمونه و حاللیت آن بنا نهاده شدهاست. همین امر وجه تمایز آن با کروماتوگرافی یونی است که در آن جداسازی براساس میزان یونیزاسیون نمونه صورت میگیرد. بنابراین نمونههای قطبیتر بازداری بیشتری روی سطح فاز ساکن غنی شده از آب نسبت به نمونههای کمتر قطبی خواهند داشت. در مقابل نمونههای با قطبیت کمتر بازداری کمتری داشته و زودتر از ستون خارج میشوند. شکل 3: سازوکار کروماتوگرافی مایع با برهمکنش آبدوستی ]8[. پدیده بازداری در HPLC به انواع مختلف برهمکنشهای همزمان بین مولکولی میان حل شونده و فاز ساکن حل شونده و فاز متحرک فاز ساکن و فاز متحرک بستگی دارد. انواع برهمکنشهای بین مولکولی در جدول )2( نشان داده شدهاست. فرضیههای موجود پیشنهاد میکند که بازداری از تفاوت توزیع آنالیت ناشی میشود. البته این فرضیه فاقد توضیح کامل و جامع است. در این روش سازوکار جداسازی بر پایه تفاوت توزیع آنالیت تزریق شده میان فاز متحرک غنی از استونیتریل و الیه غنی از آب جذب سطحی شده روی سطح فاز ساکن هیدروفیلی است )شکل )3((. هر قدر آنالیت هیدروفیلتر باشد تعادل توزیع به سمت الیه آبی تثبیت شده روی فاز ساکن حرکت میکند و بنابراین آنالیت بیشتر بازداری میشود. زمانی که غلظت استونیتریل )یا سایر حاللهای آلی( افزایش مییابد آب بیشتر با سطح فاز ساکن قطبی )برای نمونه سطح سیلیکای بدون پوشش( برهمکنش میکند. در این مورد استونیتریل نمیتواند با سیالنولهای باقیمانده روی سطح فاز ساکن برهمکنشی داشته باشد و بنابراین این سیالنولها بدون پوشش باقیمانده و مولکولهای آب میتوانند به آنها اتصال یابند.
مقاالت 11 تخصصی فصلنامه 15 پیاپی شماره 1395 پاییز 3 شماره چهارم سال ایران آزمایشگاهی دانش مثال انرژی [kjmol-1] -)2-4( -4 ]11[ متحرک فاز و ساکن فاز آنالیت میان برهمکنشها انواع 2: جدول ویژگیها و دهنده پروتون گروه یک هیدروژن میان مولکول یک درون در هیدروژن گیرنده اتم میشود. تشکیل مختلف مولکول دو بین یا و و لوییس( )باز دهنده الکترون زوج میان تشکیل لوییس( )اسید الکترون گیرنده میشود. قرار خنثی مولکول یک روی یونها میگیرند. اما الکتریکی بار نظر از خنثی جزء دو میان میآید. بهوجود لحظهای دوقطبی دارای و لحظهای دوقطبی دارای مولکولهای میان میشود. ایجاد غیرقطبی مولکولهای به شوند نزدیک هم به خنثی ذره دو اگر جذب را یکدیگر الکتروستاتیکی روش میکنند. اجزای میان جاذبه ضعیف نیروی به فاصله افزایش با که منفرد مولکولهای مییابد. کاهش سرعت مولکولهای میان آبی محیط در که نیروهایی میآید. بهوجود گریز آب هیدروژنی پیوند برهمکنش نوع دهنده-گیرنده برهمکنش یون-دوقطبی دوقطبی-دوقطبی القایی دوقطبی-دوقطبی القابی موقت-دوقطبی دوقطبی شیمیایی برهمکنش فیزیکی برهمکنش )واندروالس( مولکولی بین برهمکنشهای هیدروفوبی برهمکنشهای جداسازی برای کارآمد روشی آبدوستی: برهمکنش با مایع کروماتوگرافی
مقاالت 12 جداسازی برای کارآمد روشی آبدوستی: برهمکنش با مایع کروماتوگرافی آبدوستی برهمکنش با مایع کروماتوگرافی مزایای برهمکنش با مایع کروماتوگرافی از استفاده اصلی مزایای است: زیر شرح به آبدوستی جفت عامل یک از استفاده بدون که آبدوست ترکیبات نگهداری است مشکل معکوس کروماتوگرافی در یونی بستگی نمونه آبدوستی درجه به اول درجه در شویش ترتیب کروماتوگرافی در ستون از خروج ترتیب و انتخاب بنابراین دارد معکوس کروماتوگرافی برعکس آبدوستی برهمکنش با مایع است باال باعث متحرك فاز در آلی حالل باالی محتوای کلی بهطور میشود )S/N( نویز به سیگنال درصد رفتن فاز در آلی حاللهای پایین ویسکوزیته دلیل به کم فشار باالتری جریان شدت از که میدهد اجازه ما به امر این متحرک. ستون از که مواقعی در بهویژه کنیم استفاده سریعتر آنالیز برای فشار کلی بهطور ]12[. میشود استفاده میکرون 2 ذرات قطر با از کمتر برابر 2-3 آبدوستی برهمکنش با مایع کروماتوگرافی در است معکوس کروماتوگرافی مشاهده زمانی پدیده این پیکها. شدن شدن دنبالهدار کاهش کروماتوگرافی روش در قطبی ساکن فاز روی نمونه که شدهاست ] 13 [ میگیرد قرار آبدوستی برهمکنش با مایع درصد 100 حالل در که صورتی در جامد فاز با استخراج قابلیت خشک به نیاز بدون و مستقیم بهصورت میتوان شود حل اپروتیک ]14[. کرد تزریق دستگاه به متحرک فاز در بازسازی یا کردن با مایع کروماتوگرافی از استفاده محدودیتهای آبدوستی برهمکنش برهمكنش با كروماتوگرافي در رايج محدوديتهاي از يكي و نمونه حالل تطابق عدم از كه است پيكها شكل در آبدوستي قدرت )با آبي حاللهاي از استفاده ميشود. حاصل متحرك فاز ذرات تقسيم در اختالل باعث نمونه آمادهسازي براي باال( شويش از ميكنند. ايجاد اختالل پيك شكل در و شده ساكن فاز با نمونه بهوجود آبي كامال حاللهاي از استفاده در كه منفي اثرات ديگر و بازداري زمان كاهش ستون از شدن سرريز به ميتوان ميآيد توصيه كروماتوگرافي خوب عملكرد براي كرد. اشاره پيك وضوح باشد آلي حالل درصد 50 از بيش حاوي متحرك فاز ميشود براي حالليت سبب ميتواند موضوع اين حال اين با ]14[. با مشكل اين به همكاران و جانسون شود. قطبي بسيار نمونههاي احاطه آلي حالل با كه نمونه تزريق حلقوي لوپ يك از استفاده 15 پیاپی شماره 1395 پاییز 3 شماره چهارم سال ایران آزمایشگاهی دانش تخصصی فصلنامه كردهاند. اشاره شدهاست با كروماتوگرافي دستگاه از استفاده محدوديتهاي ديگر از كرد: اشاره زیر موارد به ميتوان آبدوستي برهمكنش آبدوستي برهمكنش با كروماتوگرافي در جنبشي سازوکار بهطور نتيجه اين كه است معكوس فاز كروماتوگرافي از كندتر است معكوس فاز از طوالنيتر برابر 4 تا 2 معمول ميشود استفاده آلي حاللهاي باالي نسبت از كه زماني شود انجام نميتواند ph دقيق اندازهگيري كروماتوگرافي ستونهاي با رابطه در اشتباه اما رايج تصوری به را تركيبات ستونها اين كه است اين آبدوستي برهمكنش با در مكرر ابهامات از يكي واقع در ميكنند. حفظ مشابهي روش ستون انتخاب آبدوستي برهمكنش با كروماتوگرافي روش توسعه است. استفاده براي مناسب نتیجهگیری روز رشد HILIC اخیر سالهای در فازهای است. بوده شاهد را افزونی شدهاند ساخته متعددی و متنوع ساکن زمینه در بهویژه وسیعی محدوده در که بسیار که آنها متابولیتهای و داروها کردهاند. پیدا کاربرد هستند قطبی فرد به منحصر جداسازی توانایی در آن بودن مکمل خصلت و HILIC به را آن معکوس فاز کروماتوگرافی برابر چند کروماتوگرافی برای ایدهآلی روش قدرت که است ساخته تبدیل بعدی افزایش چشمگیر بهگونهای را جداسازی بیشتر جداسازی برای روش این میدهد. گرفته باردار ترکیبات از قطبی ترکیبات مخلوطهای در غیرباردار ترکیبات تا دیگر دلیل است. مناسب پیچیده جفت توانایی روش این یافتن عمومیت است HILIC با جرمی طیفسنج شدن طیفسنج با HILIC متحرک فاز که چرا را باالیی حساسیت و است سازگار جرمی میآورد. فراهم نیز
مقاالت 13 فصلنامه تخصصی دانش آزمایشگاهی ایران سال چهارم شماره 3 پاییز 1395 شماره پیاپی 15 پی نوشت 1. دکتری شیمی آلی مرکز تحقیقات ریز فناوری زیستی پژوهشکده فناوریهای نوین علوم پزشکی جهاد دانشگاهی ابنسینا 2. کارشناس ارشد كشاورزي آزمايشگاه مركزي دانشگاه كشاورزي و منابع طبيعي رامين خوزستان 3. کارشناس ارشد شیمی آلی بخش تحقیقات گیاهان دارویی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور 4. عضو کارگروه تخصصی کروماتوگرافی شبکه آزمایشگاهی فناورینانو 5. High performance liquid chromatography (HPLC) 6. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) 7. Normal phase liquid chromatography 8. Aprotic 9. isocratic 10. gradients [1] Alpert AJ (1990) J Chromatogr A 499:177 196. [2] Cubbon S, Bradbury T, Wilson J, Thomas-Oates J (2007) Anal Chem 79:8911 8918. [3] Buszewski B & Noga S (2012). Anal Bioanal Chem, 402:231 247. مراجع [4] Alpert AJ, Shukla M, Shukla AK, Zieske LR, Yuen SW, Ferguson MAJ, Mehlert A, Pauly M, Orlando R (1994) Chromatogr A 676:191 202. [5] Linden JC, Lawhead CL (1975) J Chromatogr A 105:125 133. [6] Regnier FE, Noel R (1976) J Chromatogr Sci 14:316 320 [7] Rubinstein M (1979) Anal Biochem 98:1 7. [8] Thermo Scientific (2014). HILIC Separations Technical Guide. [9] Naidong W (2003) J Chromatogr B 796:209 224. [10] Hong Bui NT, Verhage JJ, Irgum K (2010) J Sep Sci 33:2965 2976. [11] Buszewski B, Krupczyńska K, Gadzała-Kopciuch RM, Rychlicki G, Kaliszan R (2003) J Sep Sci 26:313 321. [12] McCalley, D.V., 2010, J. Chromatogr. A, 1217, 3408. [13] Gritti F.; dos Santos Pereira A.; Sandra P. and Guiochon G., 2010, J.Chromatogr. A, 1217, 683. [14] Jandera P., 2011, Anal. Chim. Acta, 692, 1.